Testy RT-PCR z gardła na obecność SARS-CoV-2 fałszywie dodatnie zbierają żniwa

Mamy pandemię zakażeń wirusem SARS-CoV-2 powodującego chorobę COVID-19. Powszechnie wykorzystywanym badaniem, wspomagającym wykrywanie obecności tego czynnika zakaźnego, jest test molekularny oparty o metodę RT-PCR. Niestety, wyniki tego testu wcale nierzadko są fałszywie ujemne lub dodatnie i – również nierzadko – nijak mają się do występowania lub nasilenia objawów choroby. Konsekwencje tego mogą być dla badanych bardzo poważne, a w najgorszym ze scenariuszy mogą doprowadzić nawet do utraty życia – co zresztą już się dzieje. Skąd fałszywie dodatnie wyniki testu metodą RT-PCR i jaki związek może mieć z tym pobranie wymazu z jamy ustnej?

Tekst opiera się na EBM (Evidence-based medicine) – medycynie popartej dowodami naukowymi.

RT-PCR – na czym polega test molekularny tą metodą?

PCR to metoda laboratoryjna, pomagająca w wykryciu obecności wirusa SARS-CoV-2, a nie narzędzie do bezpośredniego diagnozowania choroby COVID-19.

Metodę określaną jako PCR opracowano do powielania materiału genetycznego w postaci DNA – po to, aby z maleńkiej próbki biologicznej uzyskać dużą liczbę kopii materiału do badań. Mając więcej kopii badanego DNA naukowiec nie musi się martwić, że jeśli coś podczas badań pójdzie nie tak (np. próbka ulegnie zniszczeniu), straci on możliwość powtórzenia badania – na przykład w razie uzyskania niepewnych wyników. Jest to szczególnie ważne, kiedy do badania mamy tylko jedną jedyną cząsteczkę DNA. Postęp w dziedzinie biotechnologii spowodował, że metodę tę z powodzeniem zaczęto wykorzystywać jako wspomagającą wykrywanie obecności określonych fragmentów DNA.

Skrót PCR pochodzi od angielskiej nazwy Polymerase Chain Reaction, co w tłumaczeniu na język polski znaczy reakcja łańcuchowa polimerazy. Polimeraza jest naturalnie występującym w komórkach enzymem, który odpowiedzialny jest za replikowanie (czyli powielanie) materiału genetycznego. Polimeraz jest wiele, ale do testu metodą PCR wykorzystuje się polimerazę DNA, ponieważ – jak wspomniano wyżej – metoda ta została opracowana do powielania łańcuchów DNA. Technika samego powielania polega na tym, że najpierw DNA, które w komórkach występuje w postaci dwuniciowej, poddawane jest denaturacji w wysokiej temperaturze (ponad 90 stopni Celsjusza). Dzięki temu uzyskuje się dwie pojedyncze, komplementarne względem siebie (odpowiadające sobie) nici DNA. Każda z tych nici może być powielona – każda jest więc matrycą (wzorcem) dla łańcucha, który powstanie na jej bazie. Następnie do każdego pojedynczego łańcucha DNA przyłączany jest tzw. starter, czyli krótki fragment DNA komplementarny do odpowiadającego mu fragmentu DNA matrycowego. Przyłączenie starterów odbywa się w dużo niższej temperaturze, bo między 45-65 stopni Celsjusza. Następnie polimeraza DNA dobudowuje do startera resztę nukleotydów w powielanym DNA (proces ten, zwany elongacją czyli wydłużaniem, przeprowadzany jest w temperaturze niższej niż denaturacja, ale wyższej od tej, w której przyłączane były startery). W rezultacie PCR powstaje DNA złożone z dwóch komplementarnych nici, z których jedna jest dawną nicią matrycową. Opisany cykl można powtarzać wielokrotnie, uzyskując dzięki temu w krótkim czasie bardzo dużą liczbę identycznych nici DNA.

W metodzie RT-PCR, która jest odmianą PCR, wykorzystuje się reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją (z ang. reverse transcription polymerase chain reaction). Stosuje się ją do powielania materiału genetycznego dostępnego w postaci RNA. Znalazła zastosowanie w testach badających obecność wirusa SARS-CoV-2, ponieważ materiał genetyczny tego czynnika zakaźnego występuje właśnie w postaci RNA a nie DNA. Żeby możliwe było wykonanie badania molekularnego z wykorzystaniem metody RT-PCR, trzeba owo wirusowe RNA najpierw przepisać na postać cDNA, czyli DNA komplementarnego do matrycy RNA wirusowego (cDNA z ang. – complementary DNA). I dopiero wtedy zastosować standardową metodę PCR – już z wykorzystaniem wspomnianej wyżej polimerazy DNA.

Skąd fałszywe wyniki w RT-PCR?

Czy wynikom badań molekularnych w oparciu o metodę RT-PCR należy bezkrytycznie wierzyć? Nie, ponieważ mogą być prawdziwe, ale też mogą okazać się fałszywie ujemne albo fałszywie dodatnie. Z tego powodu, niezależnie od otrzymanych wyników testu metodą RT-PCR, zawsze konieczna jest analiza objawów infekcji.

Przyczyn otrzymania wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych może być wiele. Tu wymienimy tylko najistotniejsze:

• PCR to bardzo czuła metoda, której przeprowadzenie wymaga zachowania nadzwyczajnego reżimu postępowania – dotyczy to zarówno procedury pobierania próbki biologicznej do badań, jak i ścisłego zachowania stałych warunków fizykochemicznych podczas samego powielania DNA. Każde odstępstwo może doprowadzić do zafałszowania wyników – wystarczy np. niewielka zmiana pH roztworu zawierającego powielany materiał genetyczny lub nieodpowiednio dobrana temperatura podczas cyklu albo nawet krótkotrwałe, niewielkie i niekontrolowane wahania prawidłowo dobranej temperatury. Do zafałszowania wyniku mogą doprowadzić także warunki, w których próbki są pobierane, np. pobór w pomieszczeniu, w którym w powietrzu unosi się aerozol wydostający się z dróg oddechowych kaszlących lub kichających ludzi.
• Przepisania informacji z RNA na cDNA dokonuje enzym odwrotna transkryptaza. To naturalny enzym wytwarzany przez wirusy mające materiał genetyczny w postaci RNA. Do tej grupy wirusów należy koronawirus odpowiedzialny za wywołanie COVID-19, ale też m.in. wirus grypy, wirus HIV, wirus różyczki, rotawirusy, inne koronawirusy. Ich materiały genetyczne mogą być w niektórych odcinkach RNA bardzo podobne. Ponieważ odwrotna transkryptaza myli się podczas swojej pracy i nie ma funkcji korekty popełnionych błędów, istnieje ryzyko, że powstający na bazie RNA materiał genetyczny w postaci cDNA nie będzie identyczny z pierwowzorem, co może poskutkować fałszywie dodatnim lub ujemnym wynikiem testu molekularnego.

Wynik testu to nie wyrocznia

Na rynku dostępne są testy molekularne oparte o metodę RT-PCR różnych producentów. Wiele z nich ma wystarczającą czułość analityczną, aby wykryć miano wirusa w fazie przedinfekcyjnej u osób zakażonych. Jednak żaden z testów nie wykazuje czułości klinicznej wystarczającej do wykrycia wirusa w ciągu pierwszych kilku dni po zakażeniu. Żaden też nie jest w 100% miarodajny w momencie szczytowej zakażalności. Ponadto, w zależności od obranej metody obliczeń statystycznych, wskazuje się, że fałszywie ujemne wyniki mogą stanowić ok. 33%, a fałszywie dodatnie – nawet ok. 66% wszystkich wyników.[1]

Procedura wykrywania obecności wirusa SARS-CoV-2 rozpoczyna się od pobrania wymazu – najczęściej z nosogardzieli, ale jest też możliwe pobranie próbki biologicznej z jamy ustnej. Technicznie polega to na pomazaniu po wyściółce nosogardzieli lub po śluzówce jamy ustnej jałowym wacikiem umieszczonym na długim patyczku. Patyczek z wacikiem powinien być następnie niezwłocznie umieszczony w jałowym opakowaniu, szczelnie zamknięty, opisany i wysłany do laboratorium. Taki wymaz może być wykonany w jakichkolwiek warunkach, np. na korytarzu przychodni pełnej chorych ludzi. Dlatego może się zdarzyć, że na wilgotnym waciku – na przykład podczas przenoszenia go w kierunku nosogardzieli lub jamy ustnej – osiądzie kropla aerozolu przesyconego wydzielinami z dróg oddechowych chorych ludzi znajdujących się blisko osoby testowanej. To wystarczy, aby wynik badania metodą RT-PCR wyszedł dodatnio fałszywy.

Mikrobiom jamy ustnej a wyniki testu metodą RT-PCR

Jamę ustną zasiedla przeciętnie kilkaset gatunków drobnoustrojów. W mikrobiomie tego obszaru znajdują się bakterie, wirusy, grzyby, mykoplazmy. Niektóre drobnoustroje z jamy ustnej mogą być wskaźnikami prawdopodobieństwa wystąpienia powikłań w przebiegu COVID-19. Takim markerem są m.in. bakterie z rodzaju Prevotella. Ale są i takie gatunki, które mają wpływ na wynik testu wykrywającego obecność koronawirusa i pojawienie się wyników fałszywie dodatnich z uwagi na podobieństwo posiadanego przez nie materiału genetycznego do RNA koronawirusa.[2]

Fot. 1. Wymaz z gardła przyczyną zwiększonej liczby fałszywych wyników.

Fałszywie dodatnie wyniki testu wykrywającego obecność SARS-CoV-2 u osób bez objawów klinicznych choroby mogą być spowodowane także tym, że wirusowy RNA – w całości lub we fragmencie – osadził się w kamieniu nazębnym. Badacze potwierdzili, że u osób, które miały robione testy PCR z nosogardzieli, nie wykryto obecności koronawirusa, ale po pobraniu materiału z jamy ustnej test wyszedł już pozytywny.[3]

Czy test RT-PCR można wykonywać z protezami w ustach i po jedzeniu?

Zalecenia są jasne: do testu przystępuje się po wyjęciu protez ruchomych. To bardzo ważne, ponieważ uzupełnienia protetyczne – podobnie jak kamień nazębny – mogą być rezerwuarem cząstek wirusowych albo tylko wirusowego RNA, który osadził się na polimerowej płycie w zagłębieniach protezy. Jeśli osoba pobierająca próbkę zrobi wymaz z gardła, ale materiał biologiczny fizycznie wymaże nie z tkanek, lecz z płyty protezy, wówczas może dojść do zanieczyszczenia wacika cząstkami RNA koronawirusa, które gdzieś osadziły się na protezie i tam przetrwały, choć nie ma żadnych objawów infekcji. Zalecanym miejscem pobierania materiału u pacjentów protezowanych jest wymaz z nosogardzieli.

Nie należy też przez 2 godziny przed testem jeść i pić ani płukać jamy ustnej płukankami o działaniu antyseptycznym. Antyseptyki zakłamują wynik testu na obecność wirusa SARS-CoV-2, ponieważ mogą eliminować na pewien czas ten czynnik zakaźny z jamy ustnej. Jeśli pacjent, który popłukał usta antyseptykiem, otrzyma wynik testu z jamy ustnej negatywny, wcale nie oznacza to, że w ciele badanego nie ma już cząstek koronawirusa.

Czynniki zakłócające przeprowadzenie testu z wykorzystaniem metody RT-PCR mogą zatem doprowadzić do tego, że jeśli w próbce pobranej do badań był wirus SARS-CoV-2, to wynik testu PCR okaże się negatywny, a osoba testowana uznana zostanie za niezakażoną – nawet, jeśli ma objawy infekcji. Występujące symptomy mogą być przypisane przeziębieniu, a pacjent – chory w rzeczywistości na COVID-19 – trafi nie do izolatki, lecz do domu, stając się siewcą wirusa w swoim otoczeniu. Ile osób z tego powodu zostanie zakażonych, a ile w wyniku ciężkiego przejścia COVID-19 umrze, pozostaje tajemnicą, bo nie prowadzono badań pod tym kątem.

Sytuacja odwrotna: w próbce nie było wirusa SARS-CoV-2, ale wskutek przypadkowego zanieczyszczenia nim materiału biologicznego albo wskutek pomyłki odwrotnej transkryptazy powstało cDNA, w którym sekwencja (kolejność ułożenia) nukleotydów odpowiada sekwencji nukleotydów w RNA koronawirusa. Efekt? Wynik dodatni testu RT-PCR, choć osoba testowana jest zdrowa. Pozytywnie fałszywy wynik może być także pokłosiem nieodpowiednio standaryzowanej procedury PCR w laboratorium.

Głos WHO i sądu

WHO prosi o przestrzeganie instrukcji odnoszących się do interpretacji wyników dla próbek badanych metodą PCR. Dla Światowej Organizacji Zdrowia decydującym czynnikiem jest liczba infekcji/chorób, a nie liczba osób, u których uzyskano wynik pozytywny lub inne „liczby przypadków”.

Na stronie tej organizacji czytamy, że większość testów PCR jest wskazana jedynie jako pomoc w diagnozowaniu „(…) dlatego pracownicy służby zdrowia muszą wziąć pod uwagę każdy wynik w połączeniu z czasem pobierania próbek, typem próbki, specyfiką testu, obserwacjami klinicznymi, historią pacjenta, potwierdzonym statusem kontaktów i informacjami epidemiologicznymi”.

Eksperci WHO, zdając sobie sprawę z zagrożeń wynikających z fałszywie dodatnich testów na obecność wirusa SARS-CoV-2, zalecają, aby każdy test dodatni u pacjentów skąpoobjawowych był powtórzony w ciągu 24-48 godzin. Chorobę trzeba potwierdzić objawami i zastosować odpowiednie działania. A nie spisywać żywe jednostki na straty, zamykając z osobami pełnoobjawowymi w jednym pomieszczeniu.

W sprawie traktowania wyników wykrywania zakażeń wirusem SARS-CoV-2 metodą RT-PCR niczym wyroczni wypowiedział się również – i to zdecydowanie – sąd w Austrii, stwierdzając, że wyniki testów PCR wymagają potwierdzenia badaniem lekarskim. Sąd wskazał, że opieka medyczna z Wiednia używa określeń „liczba przypadków”, „wyniki badań”, „historia przypadków” oraz „liczba infekcji”. To pomieszanie pojęć nie oddaje sprawiedliwości naukowej ocenie sytuacji epidemiologicznej.

Poważne konsekwencje fałszywie dodatnich wyników

W Polsce wynikowi testu molekularnego metodą RT-PCR nadal ufa się jak wyroczni. W oparciu jedynie o pozytywny wynik jednorazowego testu, bez potwierdzenia wyniku badaniem klinicznym, dawca próbki zostaje automatycznie uznany za osobę zakażoną, co jest równoznaczne z uznaniem jej za chorą na COVID-19 i wymagającą izolacji, ewentualnie kwarantanny. Ma to miejsce nawet w sytuacji, kiedy przetestowana osoba nie wykazuje żadnych symptomów infekcji koronawirusem (tłumaczy się to chorobą bezobjawową) lub jest skąpoobjawowa, a symptomy te nie są charakterystyczne i mogą być równie dobrze wynikiem zwykłego przeziębienia a nie zakażenia potencjalnie śmiertelnym koronawirusem. Jeśli skąpoobjawowy pacjent wskutek wyniku fałszywie dodatniego trafi do dwuosobowej izolatki, którą przyjdzie mu współdzielić z pełnoobjawowym chorym, istnieje bardzo duże prawdopodobieństwo, że dopiero tam ulegnie zainfekowaniu śmiertelnym koronawirusem i przy ciężkim przebiegu zakażenia umrze w szpitalu i bez kontaktu z bliskimi. Pojawiają się sygnały, że takie zdarzenia mają miejsce, ale tuszuje się je. Zrozpaczonym lub roszczeniowym bliskim nie udziela się wyjaśnień, żąda wycofania zażaleń albo grozi się konsekwencjami prawnymi w razie drążenia tematu. Ile było takich śmierci, bo zaufano pozytywnemu wynikowi testu opartego na metodzie RT-PCR jak wyroczni i nie potwierdzono wyniku pełnym badaniem lekarskim chorego? Nie doliczymy się.

Przypisy:
[1]https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7934325/
[2]https://journals.lww.com/cardiovascularendocrinology/Abstract/9000/Salivary_markers_and_coronavirus_disease_2019_.99905.aspx
[3]https://link.springer.com/article/10.1007/s00784-021-04001-8